基础知识：福尔马林固定石蜡包埋组织DNA提取

本篇文章是关于一个我们很少被问问题的题目，因为太简单，方法很常规结果也很少出错。我想说的是：福尔马林固定石蜡包埋组织的DNA提取。

什么是FFPE组织？

FFPE指的是为维持细胞核蛋白结构，先用福尔马林固定然后固体石蜡包埋，以便使用超薄切片机切成5-10微米厚的薄片的组织样品（通常是疑似肿瘤组织）。福尔马林与蛋白氨基发生了不可逆交联，保护细胞结构完整性，染色显示组织中肿瘤带来的畸形结构。但是，固定剂的交联作用对核酸来说是有害的。福尔马林石蜡和交联作用还妨碍了核酸的提取，抑制脱氧核糖核酸聚合酶、PCR扩增，都必须去除。

从这些样品中获取DNA的前景看似很暗淡。幸运的是，我们已经客服了这两种主要障碍，从FFPE组织中获得高质量DNA不再困难。

石蜡如何去除？

传统去除石蜡的方法通常是使用二甲苯，一种高度易燃的有机溶剂。组织切片用二甲苯反复冲洗数次溶解石蜡，然后在DNA提取前再用乙醇反复冲洗去除残余二甲苯。如此反复多次的冲洗步骤，每次都会有少量组织随着石蜡和有机溶剂被冲洗掉。

另一种方法是使用无毒的BiOstic Paraffin Removal Reagent(货号：12251-50)。它跟二甲苯一样好用，并且安全，可生物降解。

不去石蜡，还能获得高得率DNA吗？

我很高兴你问到这个问题。是的，能。如果你有办法提高蛋白酶K的活性使其能够穿透石蜡发挥消化功能，那就没必要非得先去掉石蜡了。减少了处理时间又能避免组织损失。

为了达到这个效果，我们推出了一对溶液组合，可制造强变性环境，高温状态下提高蛋白酶K的活性，在石蜡溶解的同时完成组织的消化。如果你有用过BiOstic FFPE Tissue DNA Kit，你就知道他们分别是FP1和FP2溶液。这两种溶液的协同作用使远高于标准蛋白酶K消化缓冲液的活性效果，使获得如下图所示的高得率DNA。在这个例子（由一客户提供）里，每样加入了一块从组织学幻灯片中去除的10微米厚切片。蓝色的样品先用二甲苯预处理，DNA提取按照厂家的操作说明执行，而BiOStic样品则无需石蜡去除步骤就直接进行提取。用分光光度法检测得率。如你所见，每片1-2微克的样品得率从0.5-10μg不等。没有一个个切片结果相近。

DNA分子量什么情况？

DNA的分子量很大程度上受固定处理方法和固定的时间影响。也会受组织本身年龄限制。通常分子量很小，大概100-500bp。你能看到，通过避免使用有机溶剂和额外的处理步骤，可减少DNA的进一步损坏和丢失（注意图中M标条带，不用二甲苯处理）。因为只有做完整个提取才能知道DNA的情况，我们通常建议使用专门为最小扩增子而设计的qPCR法检测。在右边的例子中，分析法专门针对人类GAPDH基因，扩增子大小是70bp。

能提取到FFPE组织的RNA吗？

很显然，这类样品的RNA降解会非常严重。他们并非是在RNase-free的环境下制作的，而且组织样品可能已经在室温下的橱柜里存放多年。 但我们还是有方法提取FFPE组织中的RNA，并获得宝贵数据。 通过对几处操作步骤的略微改动，我们能用BiOstic FFPE DNA Isolation Kit提取到RNA。FP1和FP2组合对于RNA来说太强烈，所以我们用对RNA更温和的中性溶液BF2（货号：24000-50-2）。提取DNA时为去除蛋白质交联而做的90℃孵育步骤不能做了。在Masuda et. al., 发表的一片文章(Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples, Nucleic Acids Research, 1999, vol. 27, No. 22, pages 4436-4443)中，使用了温度梯度法来确定RNA提取过程中哪个温度以及多长时间的孵育，能既去除掉蛋白交联也能成功进行RT-PCR。他们发现，70℃ 30min能足够完成这项工作。

如果你对我们的FFPE DNA kit或RNA提取步骤感兴趣，请告诉我们。我们会给你试用装。

总结

FFPE组织这种独特的样品类型有许多挑战，我们已经使得DNA提取部分变得相当容易。

使用 BiOstic FFPE DNA Tissue Kit最近发布的参考文献：

Shawn E. Yost, Erin N. Smith, Richard B. Schwab, Lei Bao, HyunChul Jung, Xiaoyun Wang, Emile Voest, John P. Pierce, Karen Messer, Barbara A. Parker, Olivier Harismendy, and Kelly A. Frazer. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 1–12 (2012).